LAMP Technologie

LAMP = Loop Mediated Isothermal Amplification-Technologie:

LAMP-Technologie wurde im Jahr 2000 in Japan von der Firma Eiken Chemical Corporation entwickelt (publiziert in Nucleic Acid Research von Notomi T. et al., 2000) und von der Firma Meridian Bioscience für Infektionsdiagnostik lizenziert. Es gibt mittlerweile zahlreiche Publikationen (>150) über diese Technologie.

Die Technologie verwendet komplementäre Primer für die Amplifikation, Replikation und Ausdehnung der DNA-Fragmente, um sogenannte „Stem-Loop“-Struktur zu bilden. Dafür werden insgesamt 6 Primer verwendet, die die Reaktion schnell und spezifisch machen. Dabei bildet sich das Abfallprodukt namens Magnesium-Pyro-Phosphat, der zur einen Trübung führt. Diese Trübung wird am Ende der Reaktion gemessen und ist proportional zu der DNA-Menge in der Probe. Die Ergebnisse werden qualitativ ausgewertet.

Da die LAMP-Technologie ISOTHERMAL abläuft, wird eine Temperatur von nur 63°C verwendet und die ganze Reaktion geschieht gleichzeitig. Dadurch wird kein herkömmlicher „Thermal-Cycler“ benötigt, welches wiederum ein kostengünstiges Test-System ermöglicht.

Als erste Applikation basierend auf LAMP-Technologie hat die Firma Meridian Bioscience einen molekularen Clostridium difficile Test - Alethia^® Clostridium difficile Test - auf den Markt gebracht.

Hintergrund:

Clostridium difficile gehört heutzutage zu einem der wichtigsten Verursacher der Krankenhaus-assoziierten Infektionen. C.difficile Infektionen (CDI) treten auch in der allgemeinen Population und in Nutztieren auf. Sie sind nicht mehr nur als unangenehme Komplikation nach der Antibiotika-Therapie zu betrachten. Seit 2001 hat die Prävalenz und die Heftigkeit der C.difficile Infektionen deutlich zugenommen, was zu erweitertem Interesse in der Forschung und zur Entdeckung neuer virulenter Faktoren geführt hat. Dadurch hat sich der Fokus in der Entwicklung von neuen Behandlungs- und Vorbeugungsmethoden erweitert.

Der humane Krankheitsverlauf durch C.difficile variiert von asymptomatischer Kolonisierung, Diarrhoe, pseudomembranes Kolitis, toxischer „Megacolon“ bis zum Tod.

Die Pathogenität von Clostridium difficile ist mit der Produktion von zwei Toxinen, Toxin A (Enterotoxin) und Toxin B (Zytotoxin), assoziiert. Die Gene für Toxin A und B (tcdA und tcdB) sind ein Teil des 19,6-kb langen genetischen pathogenen Locus, der zusätzlich 3 weitere Gene, tcdD, tcdE ,tcdC, beinhaltet und die Vorbedingung für die Virulenz ist.

Clostridium difficile Stämme beinhalten diesen pathogenen Locus (PaLoc) und sind toxigen oder im Falle von fehlendem PaLoc nicht-toxigen. Einige Stämme beinhalten atypische oder Variante Toxin A und B Gene und können das Krankheitsbild verursachen. Binäres Toxin kann auch präsent sein, allerdings ist dessen Signifikanz noch bestritten.

Laut den Guidelines von European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESMID), American Society for Microbiology (ASM) und Infectious Diseases Society of America (IDSA) gemeinsam mit der Society for Healthcare and Epidemiology of America (SHEA) wird die Clostridium difficile Diagnostik als Ein- oder Zwei-Stufen- Algoritmus empfohlen.

Als alleinige Methode kann ein molekularer Test eingesetzt werden.

Dazu können wir den Molekularen Alethia^® Clostridium difficile Test anbieten.

Molekulare Analyse:

Molekulare Analyse des C. difficile hat in den 1980-Jahren angefangen und man hat einen Referenzstamm-VP-10463- identifiziert. Wissenschaftler haben verschiedene Änderungen wie Deletionen, Insertionen, Punkt-Mutationen in den Sequenzierungsmustern nachgewiesen. Mit diesen Variationen haben Frau Dr. Rupnik und Ihre Kollegen ein Toxin-Typisierungs-Modell, das die verschiedenen C.dfficile Toxin-Typen charakterisiert, entwickelt.

Zurzeit sind >30 Toxin-Typen bekannt. Die meisten Änderungen kommen in den unstabilen 3’Prime End der Gene - der GROP-Region - vor.

(Rupnik, Maja “Heterogeneity of large clostridial toxins: importance of Clostridium difficile toxinotypes” FEMS Microbiol Rev. 2008 May;32(3):541-55. Epub 2008 Apr 3. Review).

Zielsequenz des molekularen Alethia^®Clostridium difficile Tesst:

Meridian hat als Ziel eine Sequenz von 204 bp am stabilen 5’Prime End der tcdA Gen gewählt. Diese kommt in allen C.difficile Toxin-Typen vor und alle Phänotypen - A-/B+, A+/B+, A+/B- und A-/B- - können somit nachgewiesen werden.

Wie funktioniert der Test?

Meridian hat ein einfaches und schnelles molekulares Test-System basierend auf der LAMP = Loop Mediated Isothermal Amplification –Technologie entwickelt.

Der Test-Kit beinhaltet alle benötigten Reagenzien in anwenderfreundlichen Test-Gefäßen; Probenvorbereitungsgefäß, Extraktionsröhrchen, Reagenzpufferröhrchen und Alethia^® Reaktionsgefäß.

Mit einigen einfachen Handgriffen ist der Test vorbereitet und die Amplifikation und der Nachweis des Alethia^™C.difficile Targets in den PaLoc-Gen wird mit dem illumipro-10^™ Instrument durchgeführt.

Die gesamte Testdauer beträgt weniger als 60 Minuten.

Alethia^™Workstation:

Eine praktische Hilfe für die Arbeitsschritte

Bestandteile des Kits und Test-Ablauf:

RTEmagicC_illumigene_C_Diff_Assay_Process

Leistungsdaten des Alethia^® C.difficile Tests:

Sensitivity	Specificity	No Samples
Meridian Package Insert Study	95.2%	95.3%	697
Noren et al, JCM 2011	98.0%	98.0%	272
Lalande et al, JCM 2011	91.8%	99.1%	472
Doing et al, DMID 2012	97.8%	99.4%	446
Boyanton et al, JCM 2011	95.2%	96.6%	139