THUNDER ™ - verbesserte TR-FRET-Technologie

Die THUNDER^TM TR-FRET-Testplattform basiert auf der Verwendung eines sorgfältig ausgewählten Paares von Donor-Akzeptor-Fluorophoren, die eine außergewöhnliche spektrale Kompatibilität und ein außergewöhnliches TR-FRET-Signal aufweisen. THUNDER-Assays verwenden ein langlebiges und hochstabiles Europiumchelat (Eu) als Donorfluorophor und ein kleines, einzigartiges far-red Fluorophor (FR) als Akzeptor. Bei einer Sandwich-Immunoassay-Anwendung wird ein Antikörper mit dem Eu-Chelat und der zweite Antikörper mit dem FR-Fluorophor markiert. Die spezifische Bindung der beiden markierten Antikörper an unterschiedliche Epitope auf dem Zielprotein erfolgt in Lösung und bringt die beiden Fluorophore in unmittelbare Nähe. Die Anregung des Donors Eu mit einer Blitzlampe (320 oder 340 nm) oder einem Laser (337 nm) löst einen FRET zum Akzeptor FR aus, der wiederum ein spezifisches TR-FRET-Signal bei 665 nm aussendet. Restenergie (nicht übertragen) aus der EU erzeugt Licht bei 615 nm. Diese langlebigen Fluoreszenzsignale werden zeitaufgelöst gelesen, um die Assay-Interferenz zu minimieren, was die Assay-Leistung erhöht (Abb. 3). Darüber hinaus wurden die Konzentrationen an Fluorophor-markierten Antikörpern in allen THUNDER-Assay-Kits sorgfältig optimiert, um den Assay-Hintergrund weiter zu minimieren und das S/B-Verhältnis zu maximieren. Bemerkenswert ist, dass die hohe Beständigkeit des Eu-Chelats gegen Photobleichung und die sehr lange Signalstabilität das Ablesen von Assays so oft wie nötig ermöglichen, einschließlich der Archivierung von Proben.

Figure 2: Abb. 2: Im Gegensatz zu Standard-FRET-Assays verwenden THUNDER ™ TR-FRET-Assays ein langlebiges Europium-Chelat als Donorfluorophor. Das spezifische FRET-Signal kann somit nach einer geeigneten Zeitverzögerung (typischerweise 50 bis 100 µs) zeitaufgelöst gemessen werden. Dies eliminiert praktisch den gesamten fluoreszierenden Hintergrund, der durch die Probe und die Kunststoffmikrotiterplatte sowie durch direkte Anregung des Akzeptors verursacht wird. Infolgedessen weisen die THUNDER TR-FRET-Assays einen sehr niedrigen Hintergrund und hohe S/B-Verhältnisse auf.

TR-FRET nutzt die einzigartigen photophysikalischen Eigenschaften von Lanthanoidmarkierungen, wenn sie als FRET-Donoren verwendet werden (Abb. 2). Lanthanoid-Markierungen haben außergewöhnlich lange Lebensdauern im angeregten Zustand, die von ein paar Hundert Mikrosekunden bis zu einigen Millisekunden reichen. Dies steht in Kontrast zu der sehr kurzen Fluoreszenzlebensdauer im niedrigen Nanosekundenbereich sowohl herkömmlicher Fluorophore, die in Standard-FRET-Assays verwendet werden, als auch der natürlichen Hintergrundfluoreszenz. Der lange Fluoreszenzabfall nach der Anregung ermöglicht eine zeitaufgelöste oder gesteuerte FRET-Signaldetektion, nachdem alle störenden kurzlebigen Signale auf vernachlässigbare Werte abgefallen sind. Die zeitaufgelöste Detektion vermeidet auch eine Störung durch die Akzeptoremission aufgrund ihrer direkten Anregung (d.h. nicht sensibilisierte Emission) und nicht durch FRET. Darüber hinaus weisen Lanthanoidmarkierungen eine große Stokes-Verschiebung (den Unterschied zwischen den Anregungs- und Emissionsmaxima) auf, die das Übersprechen minimiert. Insgesamt weisen TR-FRET-Assays aufgrund ihrer hervorragenden zeitlichen und spektralen Auflösung einen sehr niedrigen Hintergrund und hohe S/B-Verhältnisse auf, zwei Merkmale, die für die Entwicklung reproduzierbarer und robuster Assays entscheidend sind. Zu beachten ist, dass viele Mikrotiterplatten-Lesegeräte verfügbar sind, die TR-FRET-Messungen unterstützen.

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Figure 3: Abb. 3: Die Bindung von Eu-markierten und FR-markierten Antikörpern an das Zielprotein im Zelllysat bringt Donor- und Akzeptormoleküle in unmittelbare Nähe. Bei Anregung des Europium-Chelats bei 320 oder 340 nm wird Energie auf das far-red Akzeptorfluorophor übertragen, das wiederum Licht bei 665 nm emittiert. Die Intensität der Lichtemission bei 665 nm ist proportional zum Proteingehalt.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil von TR-FRET besteht darin, dass Daten entweder als Emissionssignal bei 665 nm oder als Emissionssignalverhältnis von 665 nm / 615 nm ausgedrückt und analysiert werden können. Die Verwendung der ratiometrischen Messung erhöht die Datenreproduzierbarkeit weiter, da sie kleine Pipettierfehler normalisiert und auch einige zusammengesetzte Artefakte korrigiert. In der Tat können einige Testverbindungen das Donor-Eu-Signal bei 615 nm entweder durch Absorption des Anregungslichts bei der zur Anregung des Donors verwendeten UV-Wellenlänge löschen („innerer Filtereffekt“), durch Absorption der Donoremission bei 615 nm oder durch Lichtstreuung (z.B. schwerlösliche Verbindungen). Da solche Situationen zu einer Verringerung der Intensität sowohl der Donor- als auch der Akzeptoremissionssignale führen können, korrigiert das Verhältnis 665 nm / 615 nm diese Interferenzen.

Link zum Video: Discover Thunder ™ FRET:
https://www.youtube.com/watch?time_continue=23&v=E4MYNzUCh2g&feature=emb_logo