Enzymsubstrate dienen zur Visualisierung der Protein-Antigen-Bindung. Substrate werden durch Enzyme (HRP, AP) in chromogenes Produkt umgewandelt, das an der Antikörperbindungsstelle in der Gewebeprobe ausfällt. Die Wahl des Enzymsubstratsystems hängt von der Gewebeprobe, dem Ausmaß der Antigenexpression, der Art der Probenverarbeitung und -montage und vielen anderen Faktoren ab.