Endotoxin Assay von Lonza

Die Verfügbarkeit von neuen Impfstoffen gegen SARS-CoV-2 wird die schwierigen Lockdown- Situationen in manchen Ländern erleichtern. Damit Vakzine sicher für die Anwender sind - immerhin handelt es sich um injizierbare Medikamente – müssen diese nach der Produktion auf Endotoxine überprüft werden. Das bekannteste Testverfahren ist der sogenannte LAL-Test, doch langfristig könnten neue Methoden den LAL-Test ersetzen.

 

Endotoxine sind Lipopolysaccharide, die beim Zerfall von Bakterien freigesetzt werden. Beim Menschen führen sie bei Kontakt mit Schleimhäuten und bei Übertritt ins Blut zu toxischen Reaktionen, das können Entzündungen und Fieber bis zu einem anaphylaktischen Schock sein. Jede Impfstoffcharge bzw. injizierbares Medikament muss deshalb vor Abreichung strengstens auf Endotoxinkontaminationen geprüft sein. In der pharmazeutischen Produktion erweisen sich Endotoxine dabei äußerst widerstandsfähig. Sie sind hitzeresistent und werden erst bei Temperaturen ab 180°C abgebaut. Da z.B. Hitzesterilisation Endotoxine nicht entfernt, ist es wesentlich, Ausgangsrohstoffe und das Produkt selbst - während und am Ende eines Produktionsprozesses - auf deren Vorhandensein zu testen.

 

LAL-Test

Für den sog. LAL-Test (Limulus-Amöbocyten-Lysat; kurz: LAL-Test genannt) wird üblicherweise ein Lysat aus den Blutzellen (Amöbozyten) des Pfeilschwanzkrebses (Limulus) verwendet. Da die im Blut enthaltenden Amöbocyten in Gegenwart von Endotoxinen gerinnen, liefert dieser einen verlässlichen Nachweis über Endotoxine. Für den LAL-Test werden pro Jahr etwa 430.000 Tiere allein an der US-Ostküste gefangen, um ihnen 30% ihres Blutes abzunehmen. Nach der Blutabnahme werden die Tiere wieder in der Natur ausgesetzt, trotzdem stellt sich die Frage, ob der natürliche Bestand dem Wirtschaftswachstum standhalten wird. Die wichtigsten Arten, die für den LAL-Test benötigt werden, Limulus polyphemus (US-Ostküste) und Tachypleus tridentatus (südchinesisches Meer), werden mittlerweile in der roten Liste bedrohter Arten geführt.

 

Alternativen gesucht

Die LAL-Test Produzenten sind sich der Bedeutung des Pfeilschwanzkrebses für die Sicherheit von Medikamenten und Medizinprodukten, aber auch seiner ökologischen Rolle bewusst. So hat sich Lonza, einer der wichtigsten Produzenten, verpflichtet die Bestände zu schützen, indem die besten Praktiken bei der Blutabnahme angewendet werden und aktiv den örtlichen Naturschutz zu unterstützen. Daneben investierten die Testhersteller in die Entwicklung neuer alternativer Methoden, um die Bestände des Pfeilschwanzkrebses zu erhalten. Lonza hat etwa einen Assay entwickelt, der auf Basis eines rekombinant hergestellten Faktor C Endotoxine detektiert. Somit müssen keine Pfeilschwanzkrebse als Ausgangsmaterial verwendet werden und die Abhängigkeit zu den natürlichen Ressourcen verliert an Bedeutung.

 

PyroGene rFC Assays

Der rekombinante Faktor C (rFC) wird durch Endotoxinbindung aktiviert, und das aktive Enzym spaltet dann ein synthetisches Substrat, was zur Bildung einer fluorogenen Verbindung führt. PyroGene™ rFC funktioniert durch einen einzigen enzymatischen Schritt im Vergleich zu dem für LAL-Assays erforderlichen mehrstufigen enzymatischen Prozess.

Die Reaktion wird in einer 96-Well-Mikroplatte durchgeführt und zum Zeitpunkt Null und nach einer einstündigen Inkubation in einem Fluoreszenz Reader unter Verwendung von Anregungs-/Emissionswellenlängen von 380/440 nm gemessen. In Gegenwart von Endotoxin spaltet aktiviertes rFC das fluorogene Substrat, wodurch die Lösung zum Fluoreszieren gebracht wird. Die logarithmische Nettofluoreszenz ist proportional zur logarithmischen Endotoxinkonzentration und ist im Bereich von 0,005 - 5,0 EU/ml linear.

Der PyroGene™ rFcAssay ist äquivalent zu anderen photometrischen Endotoxin-Bestimmungsmethoden, die LAL zum Nachweis von Endotoxinen gemäß den im USP-Kapitel <<1225>> "Validation of Compedial Procedures" aufgeführten Parametern verwenden. Zu diesen Parametern gehören Linearität, Spezifität, Präzision, Genauigkeit und Nachweisgrenze.

Monozyten-Aktivierungstest (MAT)

Der Monozyten-Aktivierungstest (MAT) ist ein In-vitro-Test für Pyrogene. Das Testprinzip des MAT basiert auf dem Nachweis von entzündlichen Zytokinen, die von humanen Monozyten als Reaktion auf exogene Endotoxine (LPS) und nicht-endotoxische Pyrogene (NEP) freigesetzt werden. Seit seiner ersten Aufnahme in das Europäische Arzneibuch im Jahr 2010 (Kapitel 2.6.30) ist der MAT in den USA und Europa, als eine Kompendialmethode für Pyrogentests anerkannt. Der MAT entspricht ferner dem globalen Rahmen des 3R-Prinzips (replacement, refinement, reduction of experimental animal tests).

 

Der MAT-Test wird in zwei Schritten durchgeführt: monozytäre Zellen, z.B. periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), zur Freisetzung entzündlicher Zytokine, werden mit einem Produktpräparat stimuliert, das eine pyrogene Verunreinigung enthalten kann. Am nächsten Tag wird der Zellkulturüberstand mit einem ELISA-Test auf das Vorhandensein freigesetzter Zytokine analysiert. Die Farbreaktion wird in einem Absorbanz Reader, z.B. dem ELx808 Reader von Biotek, bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 540-590 nm gemessen. Der pyrogene Gehalt der Probe wird dann gegen den Referenzstandard Endotoxin (RSE) analysiert und in Endotoxin-Äquivalenzeinheiten (EEU/mL) ausgedrückt.

 

Endotoxin-Tests bei Szabo-Scandic

Szabo-Scandic arbeitet seit mehreren Jahren mit dem Testhersteller Lonza zusammen. Wir begrüßen die Entwicklung von alternativen Testmethoden, die den Pfeilschwanzkrebs schützen und haben alle oben genannten Testmethoden, wie PyroCell MAT Assays (kontaktieren Sie uns diesbezüglich bitte) und Pyrogene rFC Assays, in unserem Sortiment.

Januar 12, 2021